2017年12月基因编辑技术CRISPR/Cas亮点盘点
来源：生物谷
基因组编辑技术CRISPR/Cas9被《科学》杂志列为2013年年度十大科技进展之一，受到人们的高度重视。CRISPR是规律间隔性成簇短回文重复序列的简称，Cas是CRISPR相关蛋白的简称。CRISPR/Cas最初是在细菌体内发现的，是细菌用来识别和摧毁抗噬菌体和其他病原体入侵的防御系统。
在2017年12月份，有哪些重大的CRISPR/Cas研究或发现呢？小编梳理了一下这个月生物谷报道的CRISPR/Cas研究方面的新闻，供大家阅读。
1.Science子刊：利用CRISPR/Cas9有望治疗渐冻人症
doi:10.1126/sciadv.aar3952
图片来自Chris Bickel/AAAS。
肌萎缩性脊髓侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis, ALS），又称路格里克氏病（Lou Gehrig’s disease），或者渐冻人症，是一种致命性的神经退行性疾病。ALS影响了大约2万名美国人，其特征在于脑干和脊髓中运动神经元的过早死亡。这种疾病引起渐进性肌肉恶化并最终导致瘫痪和死亡。还没有可用的治疗方法来延缓肌肉萎缩，目前已被批准的药物最多能够延长存活几个月的时间。
根据一项新的研究，CRISPR-Cas9基因编辑能够延长ALS小鼠模型的存活。相关研究结果发表在2017年12月20日的Science Advances期刊上，论文标题为“In vivo genome editing improves motor function and extends survival in a mouse model of ALS”。
Schaffer和他的同事猜测ALS可能通过基因组编辑来加以治疗，这是因为这种疾病的某些形式（约20％的遗传性ALS病例，占全部ALS病例的2％）是由编码超氧化物歧化酶1（SOD1）的基因发生显性突变引起的。SOD1是一种有助保护细胞免受毒性自由基攻击的酶。
这些研究人员以ALS小鼠模型中为研究对象，利用一种病毒载体将一种能够穿过脊髓进入受影响的运动神经元细胞核的病毒载体，将一种旨在切割SOD1基因的Cas9蛋白的编码基因运送到这些小鼠中。
相比于未接受治疗的小鼠，这些接受过治疗的小鼠经历着总体的症状改善---疾病发作延迟37％和存活期增加了25%。它们比未接受治疗的小鼠（具有大约四个月的寿命）多存活大约一个月的时间。
2. Nature：利用CRISPR/Cas9让小鼠恢复听力
doi:10.1038/nature25164
Tmc1基因是内耳中检测声波的毛细胞发挥正常功能所必需的。携带着Tmc1基因的某种显性突变的人和小鼠经历着渐进性听力丧失。在一项新的研究中，研究人员利用CRISPR-Cas9基因组编辑策略让这个基因的突变版本失活，从而降低贝多芬小鼠模型中的这种听力丧失。相关研究结果于2017年12月20日在线发表在Nature期刊上，论文标题为“Treatment of autosomal dominant hearing loss by in vivo delivery of genome editing agents”。
在这项新的研究中，美国哈佛大学化学生物学家David Liu和同事们设计出一种向导RNA（gRNA）来特异性地靶向这个基因的常染色体显性的致病性拷贝。他们不是利用一种基于病毒的系统来运送Cas9和gRNA序列，而是将以一种被称作Cas9-gRNA复合体的核糖核蛋白（ribonucleotide protein, RNP）封装在脂质中并进行运送。这种策略改善了这种突变等位基因的编辑选择性，因此相比于小鼠成纤维细胞培养物中的野生型等位基因，它靶向这种突变等位基因的频率增加了20倍。
接下来，这些研究人员将脂质包装的RNP复合体注射到新生的贝多芬小鼠模型（具有一个突变等位基因和一个野生型等位基因）的一只内耳中，并留下一只未接受注射的内耳作为内部对照。这些接受注射的耳朵具有完整的健康的毛细胞，但是未接受注射的耳朵到八周时具有快速的毛细胞死亡。Liu说，“这是激动人心的，这是因为这提示着相比于未接受注射的耳朵，我们能够让接受注射的耳朵保持毛细胞健康和丰度。”
这些研究
43 34995 43 15232 0 0 2180 0 0:00:16 0:00:06 0:00:10 3018人员通过监控听觉脑干反应（auditory brainstem response, ABR）来测试四周大的贝多芬小鼠模型的听力。ABR用于衡量神经元对声音的反应。未接受注射的耳朵记录了75～80分贝左右的ABR，与垃圾处理的噪音音量相当。接受注射的耳朵能够听到安静的大约60分贝的声音，这相当于安静的谈话。尽管这是一种进步，但是野生小鼠能够听到低至30～40分贝的声音，这提示着CRISPR基因组编辑部分上避免了听力丧失。到8周时，接受注射的耳朵的ABR阈值仍然低于未接受注射的耳朵，但是要高于4周时的ABR阈值，这提示着这些小鼠的听力继续恶化。对响亮声音作出的行为反应在这些接受治疗的小鼠和野生小鼠之间遵循着类似的模式。
3.Cell：重磅！在哺乳动物体内利用改造的CRISPR/Cas9治疗糖尿病、急性肾病和肌肉萎缩症
doi:10.1016/j.cell.2017.10.025
图片来自Salk Institute。
在一项新的研究中，来自美国沙克生物研究所的研究人员开发出CRISPR/Cas9基因组编辑技术的一种新版本，从而允许他们激活靶基因，同时不会导致DNA断裂，这就潜在地克服了利用基因编辑技术治疗人类疾病的一个重大的障碍。相关研究结果于2017年12月7日在线发表在Cell期刊上，论文标题为“In Vivo Target Gene Activation via CRISPR/Cas9-Mediated Trans-epigenetic Modulation”。
在初始的CRISPR/Cas9系统中，酶Cas9与指导它靶向到基因组中合适位点上的向导RNA（gRNA）结合在一起，从而在DNA上产生双链断裂。近期，一些人开始使用Cas9的“死亡”形式（即dCas9）：仍然能够靶向基因组中的特定位点，但是不再切割DNA。相反，dCas9与激活靶基因的转录激活结构域（transcriptional activation domain, TAD，起着分子开关的作用）结合在一起。但是由此产生的蛋白---dCas9-TAD---块头太大而不适合被包装到通常用于运送编码这些蛋白的基因到活体细胞内的腺相关病毒（AAV）载体中。缺乏一种高效的运送系统使得很难在临床应用中使用这种工具。
为了验证这种方法，这些研究人员使用了急性肾损伤、1型糖尿病和一种肌肉萎缩症的小鼠模型。在每种小鼠模型中，他们设计出他们的CRISPR/Cas9系统来增强可能潜在地逆转疾病症状的内源性基因的表达。就急性肾病而言，他们激活两个已知参与肾脏功能的基因，并观察到不仅这些基因表达的蛋白水平发生增加，而且这会改善急性肾脏损伤发生之后的肾脏功能。就1型糖尿病而言，他们旨在增强能够产生β细胞（即一种分泌胰岛素的细胞）的基因的活性。这种新方法又一次发挥作用，成功地降低1型糖尿病小鼠模型中的血糖水平。就肌肉萎缩症而言，他们让之前已经证实逆转疾病症状的基因表达，包括不能够很容易地通过传统的病毒介导的基因疗法加以运送的一个特别大的基因。
4.JCI：重磅！科学家有望开发出根治儿童神经细胞瘤的新型疗法
doi:10.1172/JCI90793
日前，一项刊登在国际杂志Journal of Clinical Investigation上的研究报告中，来自美国博德研究所和达纳-法伯癌症研究所的研究人员通过联合研究发现一种间接方法来对抗神经细胞瘤诱发的关键遗传损伤。
相比成人肿瘤而言，儿童癌症常常拥有相对“安静”的基因组，儿童癌症中基因突变较少，尤其是一些容易用作开发新药的靶点（比如蛋白激酶等），这些肿瘤更易于出现其它类型的遗传改变，比如基因重复或异位等。这种情况通常发生出现在高危神经细胞瘤中，神经细胞瘤是一种罕见的儿童神经肿瘤，患者机体中通常会出现MYCN基因的频繁放大，其主要会促进肿瘤细胞过量产生转录因子，即能够有效关闭和开启基因表达的特殊蛋白，而研究人员常常很难直接对其进行靶向作用。
这项研究中，研究人员通过研究发现了MYCN放大的神经细胞瘤中潜在的药物开发靶点，即癌细胞对EZH2的生存依赖性，EZH2是MYCN的一个作用靶点，其能够帮助有效控制细胞身份和行为等多个方面。研究人员利用基因组尺度的CRISPR筛查数据来阐明神经细胞瘤靶点的最初列表，在该列表中，EZH2和其两个生化配偶体：EED和SUZ12的特点比较明显。
利用信息学、基因和药理学实验，研究人员对细胞系和动物模型进行了深入研究，结果表明：1）MYCN蛋白能够直接控制EZH2的表达；2）EZH2蛋白能够阻断细胞中肿瘤抑制基因的表达，同时抑制其生长成为成熟的神经元细胞，神经母细胞瘤细胞看起来和非成熟的神经细胞非常相似；3）在体外和体内实验中，利用RNA干扰技术或药物来沉默EZH2的表达能够有效损伤神经细胞瘤的生长。
5.PNAS：不同患者的机体基因组或会影响基因编辑疗法的有效性和安全性
doi:10.1073/pnas.1714640114
目前，基因编辑技术已经开始在临床试验中进行测试了，研究人员能利用CRISPR-Cas9和其它技术来直接对人类机体细胞的DNA进行编辑，多项临床试验都处于招募受试者或计划阶段；近日，一项刊登在国际杂志PNAS上的研究报告中，来自波士顿儿童医院及蒙特利尔大学的研究人员就通过研究发现，个体与个体之间的遗传差异或许会削弱基因编辑产生的效率，在更罕见的情况下或许会造成潜在的危险的“脱靶”效应。
本文研究增加了一些新证据，即基因编辑或许需要适应每个病人的基因组，从而才能够确保被靶向作用的基因或附近DNA序列中不会出现突变。医学博士Stuart Orkin说道，人类的DNA序列并不相同，而且被认为是“正常”的DNA序列或许也并不能解释所有的差异；在设计治疗性编辑的靶向系统时我们推荐需要将常见的变异考虑在内，同时也为了能最大限度地发挥功效，减少患者潜在的安全隐患。
文章中，研究者对此前已经发布的7444个全基因组序列进行分析，基于研究人员比较感兴趣通过基因编辑来改变的30个疾病相关的DNA靶点列表，研究人员就制成了一张含有几乎3000个导向RNAs（gRNAs）的列表，当然这些只是被开发出的遗传代码的一部分，其能够直接直接指导CRISPR-Cas9酶进入到靶点附近合适的编辑位点。随后研究人员向通过研究观察是否这7444名个体机体的gRNAs中会携带DNA序列的改变。
研究者Canver解释道，如果CRISPR试剂能够用于治疗的这个位点存在一定的遗传差异，那么你可能面临治疗效率降低或疗法失败的风险；单个碱基对的差异或许会导致结合效率的降低，而这归因于导向RNA的错配，总而言之，或许就会引发患者疗法效率的下降。研究者发现，在基因组中出现这种现象并不罕见，大约有50%被分析gRNAs都会被靶点位置的突变体潜在影响；此外，在一些新的病例中研究者还发现，促进基因组中DNA序列与gRNA更好匹配的遗传突变或许会潜在地将DNA序列“拖动”到错误位置，从而就会使得基因或其它DNA区域不会被靶向作用。
6.PNAS：重大进展！制定出利用CRISPR/Cas9高效编辑基因组规则
doi:10.1073/pnas.1711979114
图片来自Alexandre Paix。
科学家们普遍认为，细胞通过随机地插入一组核苷酸来修复CRISPR/Cas9系统诱导的DNA断裂。这通常会破坏任何位于发生断裂的DNA位点处的基因。科学家们已知细胞有时利用供者DNA来修复细胞基因组中的断裂。然而，这种供者DNA序列本身不会自我插入到细胞基因组中的空白位点上。相反，这种供者DNA的每个末端都存在着一种同源臂（homology arm）以便封闭这种切割造成的空隙。
在一项新的研究中，来自美国约翰霍普金斯大学的研究人员将不同的供者DNA组合插入到人胚胎肾细胞中，这些细胞以其生长良好的能力和经常用于癌症研究中而为人所知。他们使用携带着编码一种绿色荧光蛋白的基因的供者DNA，当这种基因成功地插入到细胞基因组中时，这种绿色荧光蛋白就会在细胞的核膜上发出绿色荧光。相关研究结果于2017年11月27日在线发表在PNAS期刊上，论文标题为“Precision genome editing using synthesis-dependent repair of Cas9-induced DNA breaks”。
具体而言，这些研究人员发现长度为33～38nt的同源臂与长度为518nt的同源臂具有相同的编辑成功率，在最佳条件下产生10％～20％的编辑成功率。相反之下，当他们利用长度为15～16nt的同源臂进行测试时，这种基因插入成功率下降了一半。他们在人基因组的三个不同的位点上重复了这些结果。他们还发现新插入的DNA序列能够长达1000nt（不包括同源臂）。
这些研究人员利用长度为57～993nt的供者DNA序列取得的编辑成功率在10%～50%。更短的供者DNA要比更长的供者DNA取得更高的编辑成功率。比如，长57nt的供者DNA、长714nt的供者DNA和长993nt的供者DNA插入到细胞基因组靶位点上的成功率分别为45.5%、23.5%和17.9%。当长度超过1000nt时，长1122nt的供者DNA和长2229nt的供者DNA具有非常低的插入成功率---大约为0.5%。
7.美国食品药品管理局提醒不要随便尝试编辑自己的基因
国外的奥丁公司销售基因编辑相关的产品，并且在网上发布基因编辑操作流程的视频。而且，根据该公司的网站的介绍，它提供了48种与基因编辑相关的产品，价格在10美元～1699美元 美国食品药品管理局（FDA）在看到这个视频后，发表声明指出市场上出现的基因编辑产品属于非法的产品，这些产品的安全性并未在长时间的临床试验中受到证实，因此建议公众不要轻信这些产品。
8.首个CRISPR产品将于2018年进行β-地中海贫血I/II期临床试验
2017年12月7日，CRISPR 治疗公司（CRISPR Therapeutics）宣布提交CTX001用于β-地中海贫血治疗的临床试验申请（clinical trial application, CTA）。CTX001是一种开展过CRISPR基因编辑的实验性自体造血干细胞疗法，旨在用于治疗患有β-地中海贫血和镰状细胞病的患者。
CRISPR 治疗公司首席执行官Samarth Kulkarni博士评论说：“本公司正在开发一种新型药物，CTX001是首个开展CRISPR基因编辑疗法的临床试验产品。我们致力于将CRISPR平台的突破性科学成果转化为临床治疗，从根本上提高患有β-地中海贫血和镰状细胞病等严重疾病的患者的生活质量。”
CTX001的I/II期临床试验旨在评估其在成人输血依赖性β-地中海贫血患者中的安全性和有效性，预计将于2018年在欧洲开始。该公司还计划2018年向美国食品药品管理局（FDA）提交CTX001治疗镰状细胞疾病的临床研究申请（investigational new drug, IND）。
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